EFECTOS DE LOS PLAGUICIDAS EN EL ADN Y PROTEÍNAS

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EFECTOS DE LOS PLAGUICIDAS EN EL ADN Y PROTEÍNAS




EFECTOS DE LOS PLAGUICIDAS EN EL ADN Y PROTEÍNAS DE LARVAS DE CAMARÓN AZUL Litopenaeus stylirostris (STIMPSON, 1874) DEL GOLFO DE CALIFORNIA.


J. G. Galindo Reyesa, N. Leyva Rivasb, O. G. Millán Aguilar y M. G. Lazcano Alvarezc.


Facultad de Ciencias del Mar, Universidad Autónoma de Sinaloa.

Paseo Claussen s/n, Mazatlán, Sinaloa. C.P. 82000. México.

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ResumEn

Recientemente, ha ocurrido alta mortalidad y patologías diversas en larvas de camarón cultivado del Golfo de California; hay antecedentes que indican que esto puede estar asociado al efecto de plaguicidas. Se expusieron las larvas de camarón Litopenaeus stylirostris a Endosulfán, Azinfosmetilo, Permetrina, Paratión, Malatión, Chlorpyrifos, Carbaryl y DDT para estimar la dosis letal del 50% (LC50), y detectar posibles aductos y rupturas en la molécula de ADN, así como el contenido de proteínas. Se expusieron lotes de 20 larvas en matraces de 2 litros, a soluciones subletales de cada uno de los plaguicidas durante 4 días. Se extrajo el ADN de las larvas y se evaluó por espectrofotometría UV comparándolo y cuantificándolo contra un estándar. Se analizaron los extractos por cromatografía de líquidos de alta resolución, previamente tratados por el método del desdoblamiento alcalino propuesto por Shugart (1988). La concentración de proteínas se estimó por el método de Biuret. La LC50 menor correspondió al Carbaryl y la mayor al Malatión, lo cual indica que son el más y el menos tóxico, respectivamente. Sólo hubo rupturas del ADN en larvas expuestas a DDT. También hubo una reducción en el contenido de proteínas que es un índice del crecimiento de las larvas.


1. INTRODUCCIÓN

Los plaguicidas en ecosistemas acuáticos.

Cuando los plaguicidas son empleados, sus residuos son transportados a las distintas matrices (aire, agua, suelo) y la contaminación de fuentes de alimento para los organismos silvestres, conllevan la posibilidad de que se produzcan efectos adversos que afecten a poblaciones enteras y pongan en riesgo la supervivencia de las especies en peligro de extinción, dañando también a organismos predadores y polinizadores, entre otros. Entre los efectos más notorios están, la incapacidad reproductiva de los organismos expuestos y la muerte misma (SEMARNAP, 1996). Los plaguicidas con solubilidad en agua mayor a 500 mg/l son muy móviles en los suelos y otros elementos de los ecosistemas, su mayor concentración se encuentra en ecosistemas acuáticos. Aquellos de solubilidad mayor a 25 mg/l (como ocurre en general con los organofosforados) son menos persistentes en los organismos vivos y los que tienen solubilidad menor (como los organoclorados) tienden a inmovilizarse en suelos y concentrarse en organismos (SEMARNAP, 1996).


Ácidos nucleicos.

En estudios recientes con organismos acuáticos, se ha utilizado el contenido de ácidos nucleicos (ADN y ARN) como un indicador de toxicidad crónica en estos; en algunos casos, esta toxicidad es ocasionada por plaguicidas (Galindo, 1997). En el presente estudio no sólo se cuantificó el porcentaje relativo de ADN en los organismos tratados y el control, sino también se buscaron alteraciones en esta biomolécula, ocasionadas por los agroquímicos; cabe aclarar que el ARN no fue objeto de estudio.

Aductos en el ADN.

El potencial para utilizar los aductos en el ADN como un biomarcador de la exposición a complejas mezclas de químicos genotóxicos ha iniciado a ser válido en el campo de estudios sofisticados como el método 32P-post-marcación. Actualmente, la técnica 32P-post-marcación es semicuantitativa, laboriosa, y de costo moderado.


Ruptura en la cadena.

Muchas sustancias tóxicas pueden causar rupturas en la cadena del ADN, ya sea directa o indirectamente. El método del desdoblamiento alcalino permite estimar el incremento en el nivel de ruptura superior a la condición normal de la molécula, resultando de la exposición a estos xenobióticos. La técnica puede ser aplicada al análisis de muchas muestras sin la necesidad de reactivos o equipo de laboratorio demasiado costoso. Para el campo de estudios, los análisis de laboratorio se hacen con tejidos frescos o congelados. La información está disponible en pocas horas y es mejor interpretada en relación a la información proporcionada por otros biomarcadores. El método está idealmente adaptado para la rutina, monitoreo in situ de especies indicadoras de contaminación ambiental, debido a su facilidad y relativo bajo costo (Shugart, 1990a, b).


Proteínas.

Las proteínas poseen muy diversas funciones biológicas. Las enzimas representan la clase más amplia. Algunas como por ejemplo, el Citocromo “c”, transfieren electrones hacia el oxígeno molecular durante la respiración, o bien, como la ADN-polimerasa y las enzimas activadoras de aminoácidos, participan en la biosíntesis de los componentes celulares. En resumen, las proteínas desempeñan gran diversidad de funciones: actúan como catalizadores, como elementos estructurales, en los sistemas contráctiles, como reserva de elementos nutritivos, como vehículos de transporte, y también actúan como hormonas y como elementos de protección (Lehninger, 1995).


Los Plaguicidas en el Golfo de California.

A lo largo de la costa Occidental del Golfo de California, México, se localizan alrededor de 300 granjas de camarón, donde se cultivan larvas de Litopenaeus spp., principalmente Litopenaeus stylirostris (Stimpson, 1874), ya que esta especie ha demostrado buen desarrollo en las condiciones ecológicas de esta región, y más resistencia a algunas patologías que otras especies cultivadas en estas granjas acuícolas (Galindo et al., 2000). La producción acuícola de camarón en esta región es de aproximadamente 24,000 ton métricas por año, las cuales representan aproximadamente 119 millones de dólares, puesto que entre el 80 y el 85% de esta producción es exportada a EUA y Europa; pero en años recientes la producción de camarón en las granjas ha declinado, y las causas que se señalan son diversas (SEDESOL, 1999). La contaminación por plaguicidas es una de éstas, ya que a lo largo de la costa, una actividad agrícola intensiva es practicada y grandes cantidades de plaguicidas son aplicadas en los cultivos de estas tierras, para proteger las cosechas de plagas adversas; consecuentemente los residuos de estos xenobióticos son transportados por el viento y escurrimientos de aguas continentales hasta las lagunas costeras y estuarios donde se localizan las granjas. Debido a esto, fue considerado muy importante estudiar algunos efectos tóxicos de estos agroquímicos en larvas de Litopenaeus stylirostris, y usar las respuestas tóxicas como biomarcadores indicando la presencia de plaguicidas en el agua que se usa en las granjas de camarón, y si esto representa un riesgo para el crecimiento de las larvas, así como pérdidas económicas (Galindo et al., 2000).


La calidad del agua que se administra y las necesidades de los monitoreos ambientales, requiere el desarrollo de marcadores significativos e indicadores biológicos de exposición de tóxicos como previsores de los efectos de la contaminación. El mejor biomarcador podría ser aquel que responda rápidamente a la presencia del xenobiótico, fácil en la realización de los análisis, y a un precio accesible. Varios biomarcadores están ahora en proceso de evaluación (Adams, 1990; Benton et al., 1994; Galindo et al., 2000). Debido a que algunas sustancias xenobióticas producen alteraciones en las biomoléculas genéticas de los organismos dañados, se consideró importante conocer si los plaguicidas ensayados en este trabajo, causan cambios en el ADN de las larvas de camarón L. stylirostris. Las proteínas han sido utilizadas como biomarcadores, debido a que su metabolismo es directamente afectado por muchos xenobióticos. Varias publicaciones citan alteraciones en proteínas totales o su metabolismo en organismos acuáticos expuestos a plaguicidas (Al-Chalabi y Al-Khayat, 1989; Benton et al., 1994; Galindo et al., 1997). Por lo tanto, en este trabajo las proteínas totales fueron evaluadas para saber si los plaguicidas tienen algunos efectos sobre el metabolismo de estas biomoléculas en larvas de camarón.


2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La contaminación por plaguicidas en los ecosistemas acuáticos provoca pérdidas por enfermedades y mortandades de camarones que pueden atribuirse a la presencia de estos compuestos en el Golfo de California, como consecuencia de la gran actividad agrícola en la planicie costera. Entre las consecuencias que provoca la exposición a plaguicidas están las alteraciones en la molécula del ADN y proteínas en organismos acuáticos, por lo tanto en este trabajo tomamos esta referencia para estudiar los daños que pueden producir en las larvas de camarón azul Litopenaeus stylirostris.


3. HIPÓTESIS

Los Plaguicidas causan alteraciones en la molécula del ADN y proteínas de larvas de Litopenaeus stylirostris del Golfo de California, expuestos a concentraciones subletales de estos tóxicos.

4. OBJETIVO GENERAL

Determinar si la exposición de las larvas de Litopenaeus stylirostris a concentraciones subletales de Plaguicidas pueden causar alteraciones a nivel de ADN y proteínas en los mismos.


4.1 OBJETIVOS PARTICULARES

  1. Determinar la concentración letal media (LC50) en larvas L. stylirostris expuestos a estos plaguicidas.

  2. Comprobar la existencia de daños al ADN de los organismos expuestos a diversos Plaguicidas, mediante la determinación de ruptura y/o presencia de aductos (“parches”) en la doble cadena de ADN.

  3. Detectar el efecto tóxico de los plaguicidas sobre la cantidad de proteína en larvas de camarón.


5. METODOLOGÍA

Dos lotes certificados de 1,000 larvas de L. stylirostris en cada uno, fueron obtenidos del productor comercial “Super Shrimp”, mismo que vende estas larvas a granjas locales de camarón. Las larvas fueron aclimatadas a las condiciones de laboratorio (Temperatura 22-24°C, Salinidad 33-35 0/00, pH 8.4-8.7) y mantenidas con alimento comercial, durante 3-4 días previos a los ensayos de toxicidad. Se expusieron las larvas a Endosulfán, Azinfosmetilo, Permetrina, Paratión, Malatión, Chlorpyrifos, Carbaryl y DDT para estimar la dosis letal del 50% (LC50), y detectar posibles aductos y rupturas en la molécula de ADN, así como el contenido de proteínas. Se expusieron lotes de 20 larvas en matraces de 2 litros, a soluciones subletales de cada uno de los plaguicidas durante 4 días. Se extrajo el ADN de las larvas y se evaluó por espectrofotometría UV comparándolo y cuantificándolo contra un estándar. Se analizaron los extractos por cromatografía de líquidos de alta resolución, previamente tratados por el método del desdoblamiento alcalino propuesto por Shugart (1988). La concentración de proteínas se estimó por el método de Biuret.


6. RESULTADOS

El valor de LC50 más bajo correspondió al Carbaryl y el más alto al Malatión, lo cual indica que estos plaguicidas son el más y el menos tóxico, respectivamente, para las larvas de L. stylirostris.

Al extraer ADN de las larvas expuestas a plaguicidas y del control, las muestras fueron observadas por espectrofotometría para verificar la presencia de esta molécula. En los resultados se puede ver en cada una de ellas un máximo entre los 260 nm, siendo este valor el indicativo de la existencia del ADN.

La cantidad de ADN para cada lote de larvas expuestas a plaguicidas y sus controles se presentan en la Tabla 1. En todos los casos, la cantidad en los tratamientos fue menor que en el control.


Plaguicida

Peso larval

(g)

Absorbancia 260 (nm)

ADN (mg/g)

DDT

0.39

0.664

1.746

Azinfosmetilo

0.29

0.491

1.693

Permetrina

0.38

0.805

2.118

Paratión

0.3

0.659

2.196

Chlorpyrifos

0.36

0.694

1.927

Malatión

0.33

0.565

1.712

Endosulfán

0.36

0.698

1.938

Carbaryl

0.31

0.568

1.718

Control

0.33

0.793

2.403
T EFECTOS DE LOS PLAGUICIDAS EN EL ADN Y PROTEÍNAS
abla 1. Peso de las larvas, absorbancia y cantidad de ADN. Fig. 1.- Cromatogramas de ADN de larvas de

camarón Litopenaeus stylirostris.


En los valores de ADN (expresados como porcentaje relativo) con respecto al control, las larvas tratadas con los plaguicidas Paratión y Azinfosmetilo registraron los porcentajes más bajo y alto, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 1, la presencia de aductos y/o rupturas en la cadena de la molécula del ADN se presentaron solamente en las larvas que se expusieron al DDT, ya que este fue el único caso donde el cromatograma mostró dos picos, por el contrario en todos los demás cromatogramas correspondientes a los tratamientos y al control sólo presentan uno, esto último indica que no hubo alteración molecular. Por último, en los resultados de la cantidad de proteínas de las larvas de camarón expuestas a plaguicidas, encontramos que en todos los casos la concentración de proteína fue menor a la del control (larvas que no estuvieron expuestas). Todos los datos fueron procesados estadísticamente, y la prueba de “t de student” dio diferencias significativas, excepto para Carbaryl, (P<0.05), es decir, las muestras expuestas a este plaguicida registraron el mayor porcentaje relativo de proteínas (92%), y las expuestas a Permetrina, el menor (80%).


7. CONCLUSIÓN
Con los resultados que obtuvimos en esta tesis, se concluye que el Carbaryl y el Malatión son los plaguicidas más y menos tóxicos, respectivamente para las larvas de L. stylirostris en las condiciones de laboratorio que utilizamos, éstas fueron: Temperatura 22-24ºC, pH 7.4-8.7 y salinidad 33-35 PPM, ya que el valor del LC50 para el primero fue de 0.0298 mg/l, y para el segundo 34.197 mg/l.


Las alteraciones en el ADN que observamos en las larvas expuestas a los contaminantes, pueden ser la causa de aductos, rupturas en la cadena, mutaciones, y otras alteraciones en el ADN, como un resultado de una interacción del contaminante con la molécula, tal como se observó con el DDT, ya que en los cromatogramas se muestra claramente una diferencia (dos picos) de éste con respecto a los otros plaguicidas (un pico).


El DDT está considerado dentro de los xenobióticos conocidos como “Docena sucia”, estipulados en el Convenio de Estocolmo, realizado en esta ciudad a principios del año 2001. En esta reunión, México se comprometió con todos los países firmantes, a eliminar del mercado definitivamente a este agroquímico en un lapso máximo de tres años.

A partir de los análisis que efectuamos en las larvas de camarón azul L. stylirostris para determinar la cantidad de proteínas, y teniendo como resultados que todos los plaguicidas les causaron una disminución, principalmente la Permetrina, concluimos que esto está relacionado con un bajo crecimiento de los organismos, ya que el estrés tóxico provoca, inicialmente, una reducción de lípidos, seguido de los carbohidratos y, finalmente, de proteínas. Existe un ordenamiento jurídico que regula la utilización de los plaguicidas, residuos peligrosos, entre otros tóxicos, mismo que debe ser considerado antes de su utilización para evitar que sigan afectando a los ecosistemas, tanto acuáticos, como aéreos, como terrestres.



8. BIBLIOGRAFÍA

  1. Adams. S. M. (1990). “Biological Indicators of Stress in Fish. American Fisheries Society”. Bethesda, MD.

  2. Al-Chalabi, K. A. K. y Al-Khayat, B. H. A. (1989). “The effect of lindane on nucleic acids, proteins and cabohydrate in Tetrahymena pyriformis”. Environmental Pollution 57: 281-287.

  3. Benton, M. J., Nimrod, A. C. y Benson, W. H. (1994). “Evaluation of Growth and Energy Storage as Biological Markers of DDT Exposed in Sailfin Mollies”. Ecotoxicology and Environmental Safety. 29, 1-12

  4. Galindo, R. J. G. (1997). “Toxicidad de Algunos Plaguicidas Detectados en Ecosistemas Costeros de Sinaloa, sobre Larvas y Juveniles de Camarón”. Ph. D. Thesis. Instituto Politecnico Nacional. México, D. F.

  5. Galindo, R.J. G., Dalla-Venezia, L., Lazcano, A G. y Rivas, M. H. (2000). Enzymatic and Osmoregulation Alteration in White Shrimp Litopenaeus vannamei exposed to pesticides. Chemosphere. 40, 233-237.

  6. Lehninger, A.L. (1995). Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. Segunda edición. Ediciones Omega, S.A. Barcelona, España.

  7. Secretaría de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca. Instituto Nacional de Ecología. (1996). Lo que usted debe saber sobre los plaguicidas. Serie Plaguicidas No. 1. México, D.F. SEDESOL. (1999). Encuentro de Empresas Sociales de Pesca y Acuacultura. México, D. F.

  8. Shugart, L. R. (1988). Quantitation of Chemically Induced Damage to DNA of Aquatic Organisms by Alkaline Unwinding Assay. Aquatic Toxicology. 13, 43-52.

  9. Shugart, L.R. (1990a). Biological Monitoring: Testing for Genotoxicity, in Biological markers of Environmental Contaminants. J.F. McCarthy, and L.R. Shugart. Eds. (Boca Raton, FL: Lewis Publishers Inc.) pp. 205-216.

  10. Shugart, L.R. (1990b). DNA Damage as an Indicator of Pollutant-induced Genotoxicity, in 13th Symposium on Aquatic Toxicology Risk Assessment. W.G. Landis, and W.H. van der Schalie. Eds. (Philadelphia: ASTM Publishers Inc.) pp. 348-355.

















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