CALLITHRIX JACCHUS UNA ALTERNATIVA PARA EL ESTUDIO DE GENOTÓXICOS

CALLITHRIX JACCHUS UNA ALTERNATIVA PARA EL ESTUDIO DE GENOTÓXICOS






Callithrix jacchus: UNA ALTERNATIVA PARA EL ESTUDIO DE GENOTÓXICOS MEDIANTE LA PRUEBA DE MICRONÚCLEOS EN SANGRE PERIFÉRICA

CALLITHRIX JACCHUS UNA ALTERNATIVA PARA EL ESTUDIO DE GENOTÓXICOS


Callithrix jacchus: UNA ALTERNATIVA PARA EL ESTUDIO DE GENOTÓXICOS MEDIANTE LA PRUEBA DE MICRONÚCLEOS EN SANGRE PERIFÉRICA.


Ramos-Ibarra ML 1,2, Zúñiga-González GM 1, Gómez-Meda BC 1, Zamora-Perez AL 1, Batista-González CM 1,2, Lemus-Varela ML 3, Hernández-Sánchez EJ 1.

[email protected].

1 Laboratorio de Mutagénesis, División de Medicina Molecular, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, Instituto Mexicano del Seguro Social, Guadalajara, Jalisco, México.

2 Universidad de Guadalajara – CONACyT; CUCS, Universidad de Guadalajara, Guadalajara, Jalisco, México.

3 Servicio de Neonatología, Hospital de Pediatría, Centro Médico Nacional de Occidente, Instituto Mexicano del Seguro Social, Guadalajara, Jalisco, México.



RESUMEN:

Introducción: Todos los organismos vivos están expuestos a genotóxicos, los cuales pueden provocar fenómenos de mutagenicidad, teratogenicidad o carcinogenicidad. Una prueba sencilla para detectarlos es la de micronúcleos (MN), realizada con una gota de sangre en modelos in vivo que presenten en su circulación más de 6 eritrocitos micronucleados (EMN) espontáneos, como la marmoseta Callithrix jacchus. La presencia de MN permite observar el efecto de agentes aneuploidogénos y clastógenos. Objetivo: Demostrar que el primate Callithrix jacchus puede ser un modelo para estudios de genotoxicidad de nuevos fármacos mediante la prueba de MN en sangre periférica. Material y métodos: Se trabajaron 2 grupos (testigo negativo y experimental) con 5 animales cada uno. El grupo 1 recibió 200 ml de agua y el grupo 2 recibió ciclofosfamida a dosis de 5 mg/kg en 200 ml de agua. La administración fue intravenosa cada 24 horas por 2 días seguidos. Las muestras se tomaron a las 0, 24, 48, 72, 96 y 120 horas por corte de una garra para obtener una gota de sangre. Los EMN se contaron con microscopio de fluorescencia en 10,000 eritrocitos totales (ET), eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) en 2,000 eritrocitos policromáticos (EPC) y EPC en 1,000 ET. Resultados: Se observó incremento de EMN en el grupo de ciclofosfamida, con significancia en los EPCMN (P < 0.03) desde las 48 h, mientras el control de agua se mantuvo sin cambios. Conclusión: Aún cuando se utilizaron dosis muy bajas de ciclofosfamida se pudo observar significancia, por tanto se concluye que esta especie puede ser un adecuado bioindicador para evaluar genotóxicos o nuevos fármacos. Asimismo, se estandarizaron las condiciones requeridas para la manutención y manejo de los especimenes en el laboratorio.


1. INTRODUCCIÓN.

Todos los organismos vivos están expuestos a genotóxicos, los cuales pueden provocar fenómenos de mutagenicidad, teratogenicidad o carcinogenicidad 1-6. Una prueba sencilla y económica para detectarlos es la de micronúcleos (MN) 7-10, la cual permite detectar agentes clastógenos y aneuploidógenos 7, 11-15. Se puede realizar con una gota de sangre periférica y contar el número de eritrocitos micronucleados (EMN o eritrocitos maduros, en el caso de exposiciones crónicas de genotóxicos) o de eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN o eritrocitos inmaduros, para estudios de exposiciones agudas) (Figura 1), en modelos animales in vivo que presenten en su circulación más de 6 EMN espontáneos 16-20, como es el caso de la marmoseta (Callithrix jacchus), especie filogenéticamente más cercana al humano, lo que permite extrapolar con más confiabilidad los resultados obtenidos al realizar estudios de genotoxicidad de nuevos fármacos.


2. OBJETIVO.

Valorar a la marmoseta (Callithrix jacchus) como posible especie para estudios de genotóxicidad mediante la prueba de micronúcleos.


3. MATERIAL Y MÉTODOS.

Selección de los organismos.

Se utilizaron 10 marmosetas (Callithrix jacchus) adquiridos en el criadero “Exóticos la Puerta”, Zapopan, Jalisco con los permisos otorgados por la Dirección general de Vida Silvestre de SEMARNAT.

Manejo de animales.

Los organismos se identificaron a su llegada al laboratorio y se adaptaron por 10 días a condiciones de temperatura y luz controlados. Se colocaron de acuerdo al sexo en jaulas de acero inoxidable de 87 x 60 x 60 cm y diariamente se les proporcionó agua y alimento ad libitum.

Grupos de trabajo e inducción de EMN.

Después del período de adaptación, los 10 monos se dividieron en dos grupos. Grupo I (testigo negativo): formado por 4 machos (3 jóvenes de entre 4-8 meses de edad con peso promedio de 144 g y 1 adulto de aprox. 6 años con peso de 185 g) los cuales recibieron 0.2 ml de agua inyectable una vez al día durante 2 días. Grupo II (experimental): incluyó 4 machos (2 jóvenes de entre 4-8 meses de edad con peso promedio de 140.5 g y 2 adultos de entre 3-6 años con peso promedio de 245 g), así como una hembra joven de 6 meses de edad con peso de 186 g). Este grupo recibió 5 mg/Kg de ciclofosfamida una vez al día, durante 2 días. La dosis fue considerada de acuerdo a las dosis pediátricas utilizadas en humanos 21.

Las dosis fueron administradas por vía intravenosa en vena femoral a un volumen total de 200 ml por dosis, en ambos grupos.

Preparación y análisis de las muestras.

La toma de muestra de sangre se realizó al cortar una de las garras de la pata de los animales cada 24 h por 6 días a partir del inicio del experimento. Se elaboraron 2 frotis en portaobjetos, los cuales se dejaron secar al aire, se fijaron en etanol absoluto por 10 min., y se tiñeron con naranja de acridina (tinción específica para ácidos nucleicos) 22. Se realizó el conteo de células mediante microscopio de fluorescencia (Olympus CX31) con el objetivo 100x para el conteo de EMN/10,000 eritrocitos totales (ET), EPCMN/2,000 eritrocitos policromáticos (EPC) y la proporción de EPC/1,000 ET.

Análisis estadístico.

Se utilizó la prueba t-Student, con una p menor a 0.05.



CALLITHRIX JACCHUS UNA ALTERNATIVA PARA EL ESTUDIO DE GENOTÓXICOS





EMN


EPCMN







Figura 1. Eritrocitos normocromáticos y policromáticos en sangre periférica.



4. RESULTADOS.

Los promedios, desviaciones estándar y la significancia de las frecuencias de los EMN/10,000 ET, EPCMN/2,000 EPC/1,000 ET de los diferentes grupos se muestran en el cuadro 1. En el grupo de ciclofosfamida al comparar el valor basal con las siguientes horas de muestreo se observó incremento de EPMN (P < 0.03) desde las 48 h, mientras que el control de agua se mantuvo sin cambios.


5. DISCUSIÓN.

En el presente encontramos diferencias significativas en los EPCMN, en el grupo experimental, mientras que los EMN mostraron incremento aunque no alcanzaron significancia estadistica debido a las desviaciones estándar tan amplias que se obtuvieron. Esto pudiera deberse a que los grupos de estudio fueron de sexo y edades diferentes, pues es bien conocido que por ello puede haber diferencia en el número basal de EMN 18, 19, lo que significa que con una población más homogénea las variaciones pueden reducirse y la significancia manifestarse. Sin embargo, a pesar de tal heterogeniedad en los animales, no representó problemas para el estudio puesto que se esperaba obtener diferencias amplias, a fin de que la factibilidad del modelo fuera evidente y en trabajos posteriores cuando se contara con grupos similares las diferencias fueran más claras. Por otra parte, es importante hacer notar que los EMN generalmente se manifiestan de forma más evidente cuando los organismos están expuestos a genotóxicos por tiempos más prolongados, ya que estas estructuras se acumulan con el tiempo 2. Y cabe señalar que la dosis de 5 mg/kg de ciclofosfamida, utilizada fue muy baja, comparada con la dosis que se utiliza en ratón (50 mg/kg). Aún así, este dato resulta importante ya que el presente modelo manifestó sensibilidad a dosis muy baja, lo que representa menor daño en el individuo y menos gasto de reactivos. Cabe señalar que el modelo funcionó extraordinariamente a esta dosis mediante el conteo de EPCMN con lo que podemos concluir que la marmoseta es una opción como modelo para pruebas de genotoxicidad en períodos cortos de exposición. Finalmente, esta especie tiene características particulares que la hacen ideal para trabajarla en laboratorio por su tamaño (peso promedio menor al de una rata), su fácil manejo, factibilidad para reproducirla en cautiverio y de tomar la gota de sangre para esta prueba de MN, mediante el corte de garra, la manutención y su rápida adaptibilidad al manejo.



Cuadro I. Análisis de los grupos de estudio.

Promedio ± Desviación estándar de EMN/10,000 ET, EPCMN/2,000 EPC

y EPC/1000 ET de los grupos de estudio en los diferentes tiempos.


Tiempo


Control

n= 5





Experimental

n= 5




EMN

EPCMN

EPC


EMN

EPCMN

EPC

0 h

19.0±3.74

4.6±1.95

8.6±32.19


10.0±3.67

3.0±2.12

62.0±49.98

24 h

17.4±2.88

NS

3.4±2.79

NS

38.2±27.45

NS


10.0±6.04

NS

3.6±2.19

NS

48.8±39.47

NS


48 h

17.4±3.85

NS

6.0±3.39

NS

0.2±24.27

NS


12.2±8.29

NS

9.6±5.18

* P<0.02

58.4±49.22

NS


72 h

15.8±3.42

NS

5.6±3.29

NS

42.6±25.04

NS


16.0±9.17

NS

15.0±5.29

*P<0.01

81.6±54.01

NS


96 h

19.4±2.19

NS

3.8±2.28

NS

0.2±30.36

NS


17.2±13.81

NS

14.4±7.27

*P<0.03

1.2±36.57

NS

120 h

16.4±4.16

NS

3.8±2.49

NS

8.4±52.75

NS


16.2±12.15

NS

16.2±12.15

* p<0.01

55.2±46.22

NS


Los datos están expresados como promedio ± desviación estándar. Las comparaciones fueron realizadas entre el tiempo 0 con los otros tiempos, en cada grupo. n: tamaño de muestra; EMN: eritrocitos micronucleados; ET: eritrocitos totales; EPCMN: eritrocitos policromáticos micronucleados; EPC: eritrocitos policromáticos; * prueba t de Student; NS: no significativo. Todas las dosis se ajustaron a un volumen final de 200 µl con agua inyectable.


6. CONCLUSIÓN.

Aún cuando se utilizaron dosis muy bajas de ciclofosfamida y una n pequeña de animales, se pudo observar significancia, por tanto se concluye que esta especie puede ser un adecuado bioindicador para evaluar la genotoxicidad de sustancias o nuevos fármacos. Asimismo, se estandarizaron las condiciones requeridas para la manutención y manejo de estos especimenes en el laboratorio.



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